Tecniche di semina in un terreno di coltura (spatolamento e strisciamento)

Materiali

• 3 piastre Petri
• ansa di vetro a L
• beuta da \(300mL\) con terreno PCA sterile (\(100mL\))
• micropipetta da \(1000 \mu L\) con puntali sterili
• micropipetta da \(100 \mu L\) con puntali sterili
• pipetta graduata da \(10mL\)
• propipetta
• becco Bunsen
• nastro adesivo di carta
• pennarello vetroscrivibile
• 4 provette sterili con tappo in alluminio
• contacolonie manuale
• portaprovette
• guanti e occhiali

Sostanze

• terreno PCA sterile¹ (\(100mL\))
• acqua di stagno
• soluzione fisiologica sterile
• etanolo \(CH_{3}CH_{2}OH\) in soluzione acquosa \(70\%\)

Procedimento

1. utilizzando il nastro adesivo di carta delimitare sul bancone una quadrato di ca \(50\times50cm\) e pulirlo con una salvietta e etanolo in soluzione acquosa \(70\%\);
2. accendere quindi il becco Bunsen al centro dell’area delimitata in modo da creare un ambiente sterile all’interno del quale vanno disposti tutti i materiali di impiego;
3. etichettare le provette sterili come 1-4 ed inserire in ciascuna \(9 mL\) di soluzione fisiologica sterile;
4. inserire nella provetta 1 \(1 mL\) di acqua di stagno con una pipetta sterile;
5. utilizzando la tecnica della diluizione seriale, preparare nelle provette 1-4 delle soluzioni con fattore di diluizione rispettivamente \(10\), \(100\), \(1000\), e \(10000\);
6. distribuire ca \(15-20mL\) di terreno PCA nelle 4 piastre Petri sterili;
7. attendere che il terreno solidifichi mantenendo le piastre Petri semiaperte: etichettare quindi le quattro piastre;
8. prelevare \(0,1 mL\) dalla soluzione 1 e dopo aver sterilizzato l’ansa a L sulla fiamma del Bunsen, distribuire omogeneamente la soluzione su tutta la superficie del terreno (video);
9. ripetere l’operazione precedente per tutte le soluzioni 1-4;
10. chiudere le piastre Petri assicurandole con del nastro di carta adesivo e incubarle a \(37^{\circ}C\) per \(48h\) girandole con il terreno verso l’alto.

1. individuare la coltura con un numero significativo di colonie \(range \, 30-300 UFC\)²;
2. contare manualmente le colonie utilizzando il contacolonie manuale e il pennarello vetroscrivibile;
3. conservare le piastre Petri in frigo per la seconda parte dell’esperienza³.

Materiali

• 2 piastre Petri
• beuta da \(300mL\) con terreno PCA sterile (\(30-40mL\))
• ansa ad occhiello in metallo
• becco Bunsen
• nastro adesivo di carta
• pennarello vetroscrivibile
• guanti e occhiali

Sostanze

• piastre Petri conservate in frigo (seminate per spatolamento)
• provetta eppendorfd con \(1mL\) soluzione fisiologica sterile

Procedimento

1. utilizzando il nastro adesivo di carta delimitare sul bancone una quadrato di ca \(50\times50cm\) e pulirlo con una salvietta e etanolo in soluzione acquosa \(70\%\);
2. accendere quindi il becco Bunsen al centro dell’area delimitata in modo da creare un ambiente sterile all’interno del quale vanno disposti tutti i materiali di impiego;
3. distribuire ca \(15-20mL\) di terreno PCA nelle 2 piastre Petri sterili;
4. sterilizzata sul Bunsen e lasciata raffreddare;
5. intingere l’ansa a occhiello in una colonia isolata di una delle colture batteriche a disposizione;
6. creare un piccolo striscio a zig-zag in uno dei quadranti della piastra, esercitando una leggera pressione sull’ansa a occhiello per distribuire uniformemente i batteri sulla superficie del terreno (video);
7. dopo il primo striscio, sterilizzare nuovamente l’ansa a occhiello immergendola nella fiamma del Bunsen fino a che non diventa rossa e lasciarla raffreddare prima di usarla di nuovo;
8. reare un nuovo striscio a zig-zag in un altro quadrante della piastra, facendo in modo che l’ansa passi una sola volta sopra lo striscio precedente: questo aiuterà a diluire ulteriormente i batteri e a separare le colonie;
9. ripetere il processo di sterilizzazione e di strisciamento fino a realizzare almeno 5 strisciate sulla stessa piastra;
10. ripetere le stesse operazioni prelevando una nuova colonia da un’altra cultura batterica e seminando sulla seconda piastra Petri contenente terreno PCA sterile;
11. incubare entrambe le piastre Petri a \(37^{\circ} C\) per un periodo di \(48h\) girandole con il terreno verso l’alto;
12. osservare le piastre Petri per la formazione di colonie isolate.⁴